章永登 Nature Biotechnology | 一面镜子照亮细胞“微观宇宙”：me4Pi-SMLM实现细胞与组织纳米级三维成像

me4Pi-SMLM的核心创新在于摒弃了传统的双物镜架构，仅使用单个高数值孔径物镜配合一面位于样品上方的反射镜。激发光经物镜和样品后被反射镜反射，形成轴向驻波干涉图案；借助快速压电促动器毫秒级平移反射镜，顺序采集三幅相位调制图像（相位步进2π/3），实现自参考干涉定位（图1a）。这种设计使me4Pi-SMLM实现了2–3纳米的三维定位精度，相较传统3D-SMLM轴向精度提升约5倍（图1c-d）。相较于传统4Pi-SMLM，me4Pi-SMLM完全消除了上行光路，无需昂贵的物镜配对与复杂的双物镜对准；同时，自参考干涉模式对机械漂移具有天然的低敏感性，极大降低了光路重校准频率。这两方面共同赋予了系统优异的稳定性，并显著降低了控制复杂度、维护难度与硬件成本，使日常运行更加可靠，大幅降低了应用门槛。

图1：me4Pi-SMLM原理与性能验证

为验证me4Pi-SMLM在生物样品中的成像性能，研究团队将ALFA-tag/NbALFA体系与speed-optimized DNA-PAINT技术相结合的标记策略，对多种亚细胞结构进行了成像，该策略在解决光漂白问题的同时有效减小了标记尺寸。在对微管的成像实验中，与3D-SMLM相比，me4Pi-SMLM增强的轴向分辨率能更有效地解析单个和成束微管的中空环状结构（图2a-b）。对发光超过10帧的单分子进行统计分析显示，me4Pi-SMLM在光子数约5,500的细胞环境中实现了2–3纳米的三维定位精度（图2c-d）。核孔复合物（Nuclear Pore Complex, NPC）是具有高度有序对称结构的蛋白复合体。人源NPC由约30种不同蛋白质组成，其中结构蛋白Nup96以八重对称的双环形式排列——每个NPC包含32个Nup96拷贝，每个环由16个拷贝组成，相邻分子间的轴向距离仅约3纳米、横向距离约10纳米。这一特征使NPC成为定量超分辨成像中公认的基准模型。本研究使用me4Pi-SMLM对U-2 OS细胞Nup96-ALFA敲入细胞系进行成像（图2e），清晰分辨了NPC的双环结构，轴向截面相较3D-SMLM展现出更优异的解析能力（图2f）。通过粒子平均算法对500个NPC进行三维重构，me4Pi-SMLM几乎解析到了Nup96的全部32个拷贝及相邻蛋白，成像质量媲美传统4Pi-SMLM与埃米级别的MINSTED技术，证明了其优于10纳米的三维分辨率。内质网（ER）是具有复杂三维形态的细胞器，包含管状与片层状结构。me4Pi-SMLM对COS-7细胞内质网的成像显示，其呈现为直径60–100纳米的中空管状网络，以及传统超分辨技术难以分辨的厚度仅30–50纳米的片层结构（图2h）。

图2：me4Pi-SMLM解析亚细胞结构

为研究细胞器间的空间互作，多色成像能力至关重要。本研究在me4Pi-SMLM上集成了此前开发的回收荧光（Salvaged Fluorescence）分色技术。同时，为最大程度降低背景，研究进一步改进了Fluorogenic DNA-PAINT技术，并结合纳米抗体进行样品标记。利用单一552纳米激光同时激发AF568/Cy3B或ATTO Rho 11/Cy3B两组染料对，通过光谱分色实现双通道同步采集。采用该策略，me4Pi-SMLM对细胞中的微管与内质网进行双色标记成像（图3a-b），实现了清晰的光谱分离，串扰极低，横向和轴向均清晰分辨了内质网与微管的中空结构（图3c-d）。对内质网膜（Sec61β）与腔（KDEL）进行双色成像（图3e），高分辨率有效区分了这两个紧密相邻的腔室，清晰解析了内质网的不同亚结构（图3f-i）。

图3：双色me4Pi-SMLM成像

me4Pi-SMLM通过柱面镜引入像散以消除轴向相位模糊，使其适用于较厚样本的成像。为展示全细胞成像能力，研究对小鼠精母细胞核中联会复合体（SC）的支架蛋白SYCP3进行了成像。me4Pi-SMLM在整个细胞核范围内，在各个空间朝向与深度上均清晰揭示了SC的双螺旋特征（图4a-e）。此外，对深度达4.5微米的全细胞线粒体外膜网络进行成像，清晰分辨了线粒体膜轮廓与复杂互连结构（图4f-g）。定量分析确认，在整个成像体积内me4Pi-SMLM保持了3–5纳米的DAFL定位精度与10–15纳米的FRC分辨率。

图4：全细胞me4Pi-SMLM成像

传统4Pi-SMLM因系统复杂度高、稳定性要求严苛，一直未能实现活细胞成像。me4Pi-SMLM凭借简化的光路、增强的稳定性及对标准共聚焦培养皿的兼容性，首次将4Pi级精度应用于活细胞成像。研究以染料PA-JF549-HaloTag标记U-2 OS细胞系内质网结构，以9毫秒周期时间进行me4Pi-SMLM成像，连续采集10分钟捕捉内质网动态变化。结果以三维40–60纳米的分辨率清晰呈现了细胞外周内质网管状网络的动态过程。研究进一步将me4Pi-SMLM应用于三维单分子追踪，使用更低染料浓度和脉冲激活维持适宜的Sec61β单分子密度（图5h）。以三维6纳米定位精度与9毫秒时间分辨率，揭示了局限于内质网膜内、具有不同迁移率的Sec61β单分子活动。

图5：me4Pi-SMLM活细胞成像与单分子追踪

使用传统4Pi-SMLM对组织样本进行超分辨成像面临重大挑战：组织中的折射率不均匀性、散射及深度依赖的像差会破坏干涉所需的相位关系，降低成像质量。me4Pi-SMLM采用与单物镜3D-SMLM相当的探测配置，天然更适用于组织成像。研究首先在30微米厚小鼠脑切片中对不同深度处的线粒体外膜蛋白和光遗传学关键蛋白Channelrhodopsin-2（ChR2）进行成像（图6）。在整个组织体积内，观察到了线粒体的多种形态和沿轴突分布的ChR2簇。在约20微米成像深度内，系统维持了约6纳米的DAFL三维定位精度与优于15纳米的FRC分辨率，为神经科学研究开辟了新途径。

图6：me4Pi-SMLM脑组织成像

me4Pi-SMLM在多种复杂生物样品中均展现出卓越的纳米尺度成像性能，将4Pi技术成功突破至活细胞动态成像、单分子追踪与厚组织成像。该技术兼容DNA-PAINT、dSTORM等多种单分子成像模式，成像质量媲美传统双物镜4Pi-SMLM，为纳米尺度的原位生物学研究提供了高精度的观测手段。在性能比肩前沿技术的同时，me4Pi-SMLM大幅简化了系统架构和控制的复杂度，赋予了系统优异的稳定性、更广的样品适配性以及更低的硬件成本与维护门槛。尤为重要的是，me4Pi-SMLM具备卓越的升级兼容性。现有3D-SMLM系统仅需增加一面反射镜与一台低成本压电促动器即可完成改造，无需深厚的干涉成像专业技能或高额资金投入。这一特性使得原本局限于少数顶尖实验室的4Pi级精度成像技术，有望真正走向广泛的生物学研究群体。me4Pi-SMLM为在完整细胞及组织环境中解析纳米尺度的分子结构与动态过程提供了强有力的工具。该技术的推广与应用，将为揭示亚细胞尺度的分子机制与疾病机理开辟更多可能。

Yu, Z., Zheng, B., Zhan, Y. et al. Mirror-enhanced 4Pi-SMLM with one objective enables isotropic nanoscale imaging. Nat Biotechnol (2026). 

https://www.nature.com/articles/s41587-026-03083-7

西湖大学章永登研究员为本论文通讯作者，其团队博士生于紫荆和助理研究员郑贝博士为共同第一作者。助理研究员陈艳琴博士，博士生黎舒馨、韦宗仿，访问学生王旭龙，科研助理占雅静、代秋阳、赵文渲为本研究做出重要贡献。本工作获得西湖大学俞晓春研究员及其博士生陈琳琳、西湖大学刘长亮研究员及其博士生唐嘉欣、西湖大学何灵娟研究员及其博士生夏天畅、西湖大学吴旭冬研究员的支持与帮助。

章永登团队（https://www.westlake.edu.cn/faculty/yongdeng-zhang.html）长期致力于开发下一代超分辨率荧光显微成像技术，包括4Pi-SMS、4Pi-SIM、4Pi-SIMFLUX及me4Pi-SMLM等，为在纳米尺度阐明亚细胞结构与动态提供系统性工具。实验室长期招收博士后、科研助理及博士研究生，欢迎具有生物医学工程、物理光学、计算机、生物技术、生物化学等相关专业背景的申请者加入。要求具备良好的学习能力、独立工作能力和团队沟通能力。有意者请将个人简历发送至zhanglab@westlake.edu.cn。